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快来看一看吧峰值保留时间不稳定要这么做

产品时间:2024-09-08 来源:实验室干燥机

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详细介绍

  1)首先检查泵和混合器。使用秒表和量筒来检测流速(设置仪器流速1ml/min,用10ml量筒收集流出液10分钟,应该得到液体约10ml±0.5ml,量筒有误差,使用的试剂与仪器厂家标定泵流速时试剂不一样,最终体积也有些差异,如果超过这个范围,再分开通道检测,以找到流速不正确的原因,并排除);

  2)检查流动相组成是否变化,可以在流动相中加入跟踪剂来观察基线的变化,例如:反相条件,UV检测器,在有机相中加入0.1%丙酮,监测254nm下的基线变化,还有一种方法人工配制流动相,然后通过混合器,这时候保留时间稳定了,不再波动,那就是混合器工作不正常,或者混合不均匀,进行排除。

  1)仪器本身不太可能有问题,可能是流动相的组成变化引起的,在反相色谱中,保留因子k和流动相中的有机溶剂的体积含量成指数关系,根据经验,如果有机溶剂含量误差在1%,那保留时间的变化在5%-15%之间,大部分变化在10%左右,意味着用称量有机溶剂的方式配置流动相能得到更稳定的保留时间;

  2)流动相的脱气方式也可能会引起,最好的脱气方式是使用线分钟左右,非线分钟,这样会Z大程度的减少溶剂的挥发,还有一种方法是流动相中通过氦气,流动相被氦气平衡后,氦气流立刻关闭,避免氦气带走溶剂蒸汽,而导致溶剂组成改变;

  3)流动相的抽滤方式,通常情况下,如果个人会使用有机溶剂和水相混合流动相时,会先将流动相配置混匀好后,再进行抽滤,这样的好处是流动相混合更均匀,但是对于流动相中沸点较低的部分,在抽滤过程中会损失更大,导致流动相溶剂组成改变,建议有机相和水相分开抽滤,再进行混合,超声脱气;

  4)检测目标物是离子状态或者离子化的,那么控制流动相的pH就很重要,就算是0.1单位pH的变化都可能会导致保留时间漂移10%左右,所以准确称量pH值并保证pH仪被很好的校正了,在反相色谱柱中,随着pH值的升高,酸的保留会减少,碱的保留会增加。

  反相色谱中,分离离子或离子化的样品,保留时间会受到正确缓冲溶液的离子强度的影响,但影响会很小,可以不计,典型状况是缓冲盐的摩尔数改变20%,保留时间的变化是1%,缓冲盐的组成通常是称量的,那么大的误差是不会发生的。

  1)大部分工作者认为漂移是平衡的问题,若使用的是未修饰硅胶柱做正相色谱,这是最大有可能的原因,使用半饱和流动相改善。反相色谱中,平衡通常会很快,5-10个柱体积的流动相通常就足够平衡了,但不全是如此,典型的就是离子对色谱中,使用离子对试剂平衡色谱柱,由于离子对试剂的浓度在2-5mmol/L甚至更低的浓度,它们要吸附在反相色谱柱填料表面,表面浓度在0.5-2μmol/m2,1根4.6*250mm的色谱柱大约有3g填料,需要2mmol的离子对试剂进行完全的柱平衡,流动相浓度为2mmol时,那需要1L流动相进行平衡,这个虽然是J端条件,但是用几百毫升的流动相去平衡色谱柱也是正常的,因此离子对色谱中,使用了有机溶剂清除了离子对试剂,这样第二天需要更长的时间平衡色谱柱。这两个现象都是流动相中有低浓度的强吸附试剂导致的,这是保留时间漂移最常见的原因,也还有别的原因。

  如果第一个图得到一条平滑的曲线,那么流动相是引入杂质的原因,如果第二个图得到一条平滑的曲线,那么杂质的来源是样品。

  3)键合相水解,色谱柱制造商会制定一个pH范围,超出范围可能会引起键合相不稳定,然而,很多情况下使用者不得不在接近这个pH极限,但是并没有一个明显的分界线,因为水解还取决于其他因素,如:温度,有机溶剂,缓冲盐的浓度和种类,样品的化学性质等,因此这个水解也有几率发生在这个pH范围内。要保存固定相的水解稳定性,最好是在中性pH值(3-5左右)和低温下。等度条件稳定性优于梯度条件,在等度条件下发生水解的过程中,键合相通常会发生自我吸附,并达成一种区域平衡,在使用高浓度的有机溶剂时,在梯度时或者冲洗色谱柱时,这种平衡会被打破,键合相被冲出色谱柱。

  4)温度的变化,如果样品是自动分析过夜或者过了周末,那保留时间的漂移可能和实验室的气温变化有关,在很多地方,室温的设置在晚上或者周末是不一样的,通常来说,1℃的变化导致保留时间的漂移大约在1%到2%。这个能联系最后一个导致保留时间漂移的原因--柱压的增加,柱压的异常升高,表明色谱柱被污染,仅仅是筛板被堵塞就可能会引起保留时间漂移,是因为,为了使流动相通过筛板,需要额外的压力来促使流动相通过筛板,这会使流动相在摩擦的过程中受热,因此导致保留时间的漂移。

  5)反相色谱键合相发生了“相塌陷”,由于流动相中有机溶剂比例太少,高键合覆盖率、“完全封端”的C18没有很好的被流动相浸润,这会使得流动相和固定相没有很好的接触,造成键合相卷曲,固定相之间相互吸附,因此导致固定相可以和样品相互作用的表面积减少,使得保留时间逐渐变短。这时候立即用一定量的有机溶剂(建议40%乙腈水)冲洗色谱柱可以使键合相恢复,这种现象在短链烷烃结合,未封尾的反相键合相上则很少发生,或者是不发生。

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